人白細胞介素5ELISA 試劑盒
產(chǎn)品編號：SEKH-0012
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本

Human IL-5 ELISA KIT

Human IL-5 ELISA KIT

背景介紹：
      人IL-5由抗原活化的 CD4+T 細胞產(chǎn)生，在小鼠則由Th2亞群細胞產(chǎn)生。天然IL-5的分子量為40~50KD， 是由二硫鍵連接的二聚體糖蛋白，但是單體 IL-5 也有 IL-5 活性。人的 IL-5 由 134 氨基酸殘基組成，含 22 氨基酸殘基信號肽，2 個(gè)糖基化點(diǎn)，人和小鼠 IL-5 基因分別定位于第 5 號和第 11 號染色體，人和鼠 IL-5 在 氨基酸水平上有 70％的同源性，人和鼠 IL-5Rα鏈有 79％的同源性。IL-5 主要有促進(jìn) B 細胞分化與生長(cháng);誘 導嗜酸性粒細胞分化;促進(jìn) IgA 合成;誘導細胞毒 T 細胞(CTL)的生成以及刺激嗜酸性粒細胞增殖、分化及活 化等作用。

檢測原理：
     Solarbio  ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗人 IL-5 單克 隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本，標準品和樣本中的人 IL-5 會(huì )與酶標 板上的包被抗體充分結合；洗板后加入生物素化抗人 IL-5 抗體，該抗體會(huì )與板子上包被抗體捕獲的標準品 和樣本中的人 IL-5 發(fā)生特異性結合；洗板后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈 霉親和素會(huì )發(fā)生高強度的非共價(jià)結合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的人 IL-5， 則 HRP 會(huì )使無(wú)色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍色物質(zhì)，加入終止液后反應孔會(huì )變成黃色；后，在 λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣品吸光度（OD），樣本中的人 IL-5 濃度與 OD 成正比，通過(guò) 繪制標準曲線(xiàn)和四參數擬合軟件便可計算出樣本中人 IL-5 的濃度。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過(guò)期的試劑。
2. 試劑盒未使用時(shí)應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過(guò)程中微量液體會(huì )沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來(lái)源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。
8. 為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線(xiàn)。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請帶上手套并注意防護；在操作過(guò)程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請按國家生物
實(shí)驗室安全防護有關(guān)管理規定執行。

自備實(shí)驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長(cháng) 450nm，參考波長(cháng) 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無(wú)菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時(shí)內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時(shí)內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過(guò)程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時(shí)內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于標準品的值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實(shí)驗前做預實(shí)驗以確定稀釋倍數。

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實(shí)驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入
37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標準品梯度稀釋?zhuān)杭尤霕藴势?樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕 輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500?1?78?1?76L標準品/樣本稀釋液（SR1），按照以下濃度 進(jìn)行2倍稀釋?zhuān)?00（標準品稀釋液700ul+溶解好的標準品原液300ul）、150、75、37.5、18.75、9.375、 4.68、0 pg/ml進(jìn)行稀釋。300pg/ml為標準曲線(xiàn)點(diǎn)濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線(xiàn)的 零點(diǎn)（0pg/ml）。復溶過(guò)的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并 將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍

應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。

5. 酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結合物稀釋成1 倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。

6. 洗滌方法： 

自動(dòng)洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。 

手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長(cháng)測定 OD 值。選擇雙波長(cháng)檢測，參考波長(cháng)為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長(cháng)檢測，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個(gè)標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值

3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線(xiàn)，樣品中IL-5含量可通過(guò)對應OD 值由標準曲線(xiàn)換算出相應的濃度。

4.若標本 OD 值高于標準曲線(xiàn)上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數。

1. 數據及標準曲線(xiàn)

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線(xiàn)計算人 IL-5 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-5 濃度達 2pg/ml，
20 個(gè)零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標準差，計算相應的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與人 IL-3、IL-5 Rα、IL-5 Rβ反應，小鼠 IL-5 等反應。

4. 重復性：
板內，板間變異系數<10%。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細胞培養上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的人 IL-5，計算回收率。

6. 線(xiàn)性稀釋?zhuān)?/strong>

分別在選取的 4 份健康人血漿和細胞培養上清中加入高濃度人 IL-5，在標準曲線(xiàn)動(dòng)力學(xué)范圍內進(jìn)行稀 釋?zhuān)u估線(xiàn)性。